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1) 引物用量偏大，引物的特異性不高。應(yīng)調(diào)換引物或降低引物的使用量。

2) 循環(huán)的次數(shù)過多。適當(dāng)增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。

3) 酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好。應(yīng)降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。

4) 退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應(yīng)提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴(kuò)增。以2度為梯度設(shè)計(jì)梯度PCR反應(yīng)優(yōu)化退火溫度。

5) 樣品處理不當(dāng)。

6) Mg2+濃度偏高。因適當(dāng)調(diào)整Mg2+使用濃度。

7) 若為PCR試劑盒。也可能時試劑盒本身質(zhì)量有問題。

8) 復(fù)制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準(zhǔn)備反應(yīng)體系或采用熱啟動聚合酶。

9) 反應(yīng)緩沖液未*融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化*并*混勻。

10) 引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。

11) 引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。

12) 模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。

13) 外源DNA污染。確保操作的潔凈。